藏红花素对光老化皮肤成纤维细胞的影响

　　皮肤光老化（Photoaging）是由于皮肤长期受到日光照射所引起的损害，表现为皮肤粗糙、增厚、深而粗的皱纹，局部有过度的色素沉着或毛细血管扩张等，其病理机制主要包括紫外线抑制皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌，促进基质金属蛋白酶合成而导致胶原降解等。改善皮肤光老化的方法有很多，包括药物治疗、外科治疗、注射性治疗等，其中 抗衰老化妆品的应用较为普及。

　　藏红花（番红花，Crocus sativus L.），是一种鸢尾科番红花属的多年生花卉，含胡萝卜素类化合物，主要成分为藏红花素（Crocin）和藏红花酸（Crocitin）。藏红花具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老和美容 养颜的功效，其作用机理的亚久主要集中于藏红花素，重点在免疫调节、抗肿瘤等方面，而在抗皮肤衰老方面缺乏相关研究。基于光老化过程中的病理变化，研究藏红花素对皮肤成纤维细胞的影响，有望从细胞水平阐明藏红花素抗皮肤光老化的作用与机理，为推广应用提供理论依据。

　　为了明确单纯藏红花素对细胞是否有毒副作用，首先对培养至第3或4代的皮肤成纤维细胞予以不同浓度藏红花素（0、50、100、200 μM）处理。孵育72 h后，CCK－8试剂盒检测细胞增殖情况。结果显示，低浓度（50、100 μM）藏红花素对成纤维细胞增殖无显著影响，而高浓度（200 μM）藏红花素可显著促进成纤维细胞增殖，提示藏红花素对成纤维细胞无毒副作用。

　　为了探索合适的照射剂量，给予第3代皮肤成纤维细胞不同剂量的UVB照射（25、50、100 mJ/cm2），72 h后应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。结果显示，UVB照射能抑制成纤维细胞增殖，抑制作用与照射剂量呈量效依赖关系，根据抑制作用程度，选择100 mJ/cm2作为光老化模型的照射剂量。

　　不同浓度藏红花素（0、12.5、25、50、100 μM）预处理皮肤成纤维细胞24 h，UVB（100 mJ/cm2）照射后即刻检测细胞内ROS，与不照光的对照组相比，UVB照射显著增加细胞内ROS含量，而抗氧化剂维生素C可抑制ROS的产生，藏红花素同样也能抑制ROS的产生。

　　细胞周期分析显示，紫外线照射后G0/G1期细胞数量减少，G2/M期细胞显著增加，而维生素C和藏红花素处理都能恢复细胞周期，使之与正常细胞周期接近

　　细胞增殖检测显示，紫外线照射后出现细胞增殖抑制，而维生素C和藏红花素都能抵抗紫外线的抑制作用，恢复细胞增殖。

　　RT-PCR分析显示，细胞Ⅰ型胶原的表达在紫外线照射后显著降低，而维生素C和藏红花素处理均能恢复细胞Ⅰ型胶原的表达。

　　皮肤光老化常见于长期户外工作的人群，其外观表现与自然老化的皮肤明显不同。自然老化通常表现为皮肤变薄、松弛，而光老化皮肤表现为皮肤粗糙、增厚、深而粗的皱纹，局部有过度的色素沉着或毛细血管扩张等。文献报道一名从事货运25年的卡车司机，其左半侧脸因受长期光照，呈现出光老化的皮肤改变，而右半侧表现为皮肤自然老化的特征，显示了光老化的累积效应。皮肤光老化的病理机制研究认为，紫外线对皮肤上皮细胞和成纤维细胞产生损伤，抑制细胞增殖和胶原的分泌，诱导基质金属蛋白酶合成的增加，进而促进胶原的降解。紫外线照射可使细胞内的ROS增加，影响细胞活力和功能，还可引起DNA突变，导致细胞凋亡或细胞周期阻滞。

　　皮肤光老化的预防主要在于减少紫外线辐射，和涂抹防?鹚?龋?杂谝丫?茏贤夥?涞钠し簦?梢圆捎帽；ば缘拿婺ば薷吹确椒ā４铀鹕嘶?品治觯?哂锌?OS产生的化合物，理论上可以起到修复的作用，除了常见的还原剂（如维生素C）以外，一些植物及中药提取物也被广泛应用，例如芦荟、藏红花等。藏红花是传统中药材，具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老和美容养颜的功效。研究表明，藏红花素具有抗氧化作用，能保护氧化应激引起的心肌细胞、肾上皮细胞和角膜上皮细胞损伤等。因此，我们推测其可以对抗光老化过程中，细胞内异常增高的ROS，进而修复损伤的细胞。

　　本研究首先分析了藏红花素对皮肤成纤维细胞的毒副作用，我们检测了50、100、200 μM藏红花素对成纤维细胞增殖的影响，结果显示，低浓度（50、100 μM）藏红花素对成纤维细胞增殖无显著影响，而高浓度（200 μM）藏红花素能促进成纤维细胞增殖，提示藏红花素对成纤维细胞无毒副作用，这与文献报道的相关结果一致。

　　紫外灯照射是常用的光老化模型，不同剂量的照射可以产生不同的生物学效应，以往研究采用的照射剂量有一定的差别，低剂量照射可以产生细胞老化作用，而大剂量的紫外线照射可以直接引起细胞的坏死和凋亡。为了建立光老化模型，我们探讨了不同的紫外线照射剂量对细胞的影响，合适的照射剂量可引起细胞的损伤，但不会导致细胞的坏死和凋亡，以达到造成细胞老化的目的。本实验中，皮肤成纤维细胞在受到不同剂量紫外线照射后，细胞增殖均有抑制，并呈量效依赖关系，该剂量范围内没有发现细胞坏死和凋亡。因此，实验选择100 mJ/cm2为光老化模型照射剂量。

　　为了证实藏红花素抗皮肤成纤维细胞光老化的作用，我们对药物及紫外光照处理的细胞进行了多个指标的分析。本实验中，皮肤成纤维细胞在受到紫外线照射后，出现胞内ROS水平升高，细胞周期在G2/M期阻滞，细胞增殖下降，Ⅰ型胶原合成减少，但没有发现细胞坏死和凋亡，符合细胞光老化的特征。阳性对照组维生素C处理，可降低胞内ROS水平，恢复细胞的增殖能力，与文献报道一致[14-15]。本研究发现，藏红花素处理同样具有降低胞内ROS的作用，并能对抗紫外线照射引起的细胞周期阻滞，恢复细胞的增殖能力，这可能与藏红花素降低胞内ROS水平，使得DNA损伤减少有关。提示藏红花素具有抗皮肤成纤维细胞光老化的作用。研究中，我们采用了不同的药物剂量，但没有看到明显的量效依赖关系，说明在现有的损伤程度下，低剂量藏红花素可能已产生饱和的作用。反复多次照射，加大细胞损伤后，藏红花素是否会显示更显著的保护作用，则需要进一步探讨。

　　以往研究表明，紫外照射引起细胞内ROS增多，可导致一系列信号通路的激活或抑制。比如抑制TGF-β通路，抑制细胞外基质胶原的合成；激活MAPK通路，导致基质金属蛋白酶生成增多，促使胶原蛋白等降解增多。我们推测，藏红花素也是通过降低胞内ROS水平，进而激活或抑制相关信号传导通路，使胶原合成增加，基质金属蛋白酶生成减少，相关信号通路分子的变化正在进一步研究中。

　　综上所述，本研究证实，藏红花素可通过减少细胞ROS，产生抵抗紫外线照射作用，恢复皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成能力，起到抗光老化作用。